O sangue é um tecido conjuntivo líquido que circula pelo sistema vascular em animais com sistemas circulatórios fechados. É constituído por uma porção celular de natureza diversificada – os “elementos figurados” do sangue – que circula em suspensão em meio fluido, o plasma. Nos animais vertebrados, estes elementos figurados são produzidos na medula óssea, processo esse denominado de hematopoiese. Os elementos figurados que mais contribuem para esta fracção do sangue são os eritrócitos (glóbulos vermelhos), que são os responsáveis pela cor vermelha do sangue, devido à presença de hemoglobina (a complexação dos grupos heme da hemoglobina com iões ferro (II) levam à emissão de luz da ordem do vermelho). Em animais invertebrados a coloração pode variar, possuindo em várias espécies uma cor azulada, dada a presença de cobre e não ferro na estrutura das proteínas transportadoras de oxigénio. O sangue tem como funções o transporte de nutrientes, substâncias excretadas, oxigénio e dióxido de carbono, hormonas, anticorpos, e muitas outras moléculas.
Da esquerda para a direita: eritrócito; plaqueta; leucócito
Além dos eritrócitos, muitos outros elementos figurados compõem a fracção celular do sangue. São exemplo as plaquetas, responsáveis pela coagulação do sangue. O outro tipo de elementos que constituem o sangue é o dos leucócitos (glóbulos brancos). Estes podem dividir-se em dois grupos: o grupo das células polimorfonucleares, ou granulócitos – neutrófilos, eosinófilos, basófilos; e o grupo das células mononucleares, ou agranulócitos – linfócitos, monócitos, macrófagos e células Natural Killer, NK.
Este segundo grupo de células (agranulócitos) é muito usado na investigação em Imunologia, (e.g. no estudo das doenças auto-imunes, na produção de vacinas, na imunologia dos transplantes, etc) sendo, por isso, prática comum a obtenção de suspensões por separação destas células do sangue.
O ficoll é um polissacárido muito ramificado. A deposição de uma solução aquosa de Ficoll-Metrizoato de sódio, aquando uma centrifugação do sangue (previamente heparinado/desfibrinado e diluído), leva à agregação dos eritrócitos e dos granulócitos e à formação de um gradiente de concentrações. Assim, e como resultado deste gradiente de concentrações, formam-se três camadas: uma inferior, correspondente ao sedimentado os elementos figurados que agregram com o Ficoll; uma superior, correspondente ao plasma; e uma intermédia – buffy coat – correspondente à fracção de células mononucleares. Este anel interfacial (enriquecido em células mononucleares) é depois cuidadosamente transferido para um novo tubo de ensaio, à qual é adicionado PBS e a suspensão é centrifugada. A seguir rejeita-se o sobrenadante e o sedimento é ressuspendido em 500 µL de PBS. Por fim procede-se à determinação da concentração celular da suspensão por contagem do número de células em câmara de Neubauer, diluindo-se previamente a suspensão celular a 1:10 em solução de Turk (constituída por ácido acético a 6% e por violeta de genciana, esta solução destrói os eritrócitos que possam existir na suspensão e cora os núcleos das células mononucleares de violeta).
Fontes: Wikipédia – Sangue | Wikipédia – Células mononucleares | Wikipédia – leucócitos | Wikipédia – Ficoll | Merck millipore – Solução de Turk