A técnica de Real-time quantitative PCR tem vindo a ser muito utilizada para a quantificação da variação de expressão de RNA entre amostras. Um dos principais factores que estimularam a utilização desta técnica é a procura de dados moleculares que suportem observações fenotípicas. A sua simplicidade prática, em conjunto com a sua rapidez, sensibilidade e especificidade em ensaios homólogos, faz desta técnica o pilar de suporte para a quantificação de ácidos nucleicos.
No entanto, são muitos os erros técnicos que podem afectar estes ensaios, e para que os dados obtidos possam ser fidedignos e passíveis de serem publicados, e para que as experiências de qPCR possam ser reprodutíveis, deve-se ter em conta as instruções dos MIQE (Minimum Real-Time PCR Experiments).
Em primeiro lugar convém referir-se que a abreviação qPCR deve ser usada para real-time quantitative PCR (real-time PCR quantitativo), e RT-qPCR ser usado para reverse-transcription quantitative PCR (PCR quantitativo reversamente transcrito), de forma a evitar-se confusões. Os genes usados para a normalização devem ser mencionados como genes de referência (reference genes). O ciclo parcial do PCR usado para quantificação deve ser referido como Cq (quantification cycle).
Antes da execução prática, um planeamento apropriado da experiência é fulcral para os estudos de expressão de genes, tendo em consideração os grupos controlo, o tipo e número de réplicas, as condições experimentais e os métodos de manuseamento das amostras.
Os principais erros que afetam a performance são o armazenamento inadequado das amostras, a sua preparação indevida e a qualidade e integridade dos ácidos nucleicos extraídos, que levam a resultados muito variáveis, principalmente quando se tratam de experiências com RNA, dada a sua fácil perturbação pelos métodos de extracção e processamento. Consequentemente é importante referir em detalhe como foram obtidas as amostras de tecido e se estas foram processadas imediatamente. Caso não o tenham sido, é necessário mencionar como foram preservadas e durante quanto tempo as amostras permaneceram nestas condições.
A extracção de ácidos nucleicos constitui um segundo passo crítico. A eficiência da extracção depende da homogeneização adequada dos tecidos, do tipo e da quantidade de amostra a ser processada. Sendo assim, é também fulcral a menção detalhada dos métodos de extracção de ácidos nucleicos usados. No caso da extracção de RNA, se as amostras forem coleccionadas ao longo do tempo e precisarem de ser armazenadas, estas devem ser preservadas em condições apropriadas (-80ºC, ou em RNA storage solution) até serem utilizadas. Para minimizar o tempo de manuseamento durante a extracção de RNA, é recomendado que estas sejam processadas em pequenas porções. É também importante a quantificação do RNA extraído por espectrofotometria (NanoDrop) ou por análise de microfluidos (Bio-Rad Experion), sendo recomendado utilizar-se sempre o mesmo método de quantificação em todas as amostras.
A obtenção de RNA de elevado grau de pureza e elevado grau de integridade é um dos pontos mais críticos para os estudos com RT-qPCR. Em relação às contaminações com proteínas e compostos fenólicos, estas podem ser identificadas espetrofotometricamente através da razão OD260/280 em pH neutro, sendo recomendado um rácio compreendido no intervalo 1,8-2,0.
Em relação às contaminações com gDNA, é recomendado o tratamento do RNA por digestão com DNase, sendo essencial referir o tipo de DNase, as condições da digestão efectuada e os resultados da comparação dos valores Cq obtidos com um controlo positivo e com um controlo RT-.
No que diz respeito à integridade do RNA extraído, esta pode ser analisada por electroforese em gel de agarose com brometo de etídio, na qual se poderá identificar duas bandas correspondentes às subunidades do rRNA, devendo-se observar uma intensidade da banda maior correspondente ao dobro da intensidade da banda menor. No entanto, a melhor forma de avaliação da integridade do RNA é a utilização de sistemas como ExperionTM, que permitem a obtenção do valor de RQI (RNA quality indicator). Após a obtenção de uma amostra de RNA que satisfaça os requisitos de qualidade, esta deve ser imediatamente utilizada em experiências de RT-qPCR, ou convertida, por transcrição reversa, a cDNA. A quantidade de RNA usado deverá ser igual para todos os ensaios, assim como o tempo de reacção. O cDNA deverá depois ser preservado a -20ºC ou a -80ºC até ser diluído e utilizado em qPCR. É importante mencionar detalhadamente na publicação o protocolo e os reagentes usados na conversão de RNA a cDNA, incluindo a quantidade de RNA transcrita, a estratégia de priming, o tipo de enzima, o volume, a temperatura, o tempo de reacção da transcrição reversa, sendo recomendada a realização de duplicados ou triplicados.
Em relação ao desenho dos primers, as sequencias destes devem ser únicas (sem repetições), obtidas a partir do Primer-blast, com 75-150 bp, com um conteúdo em GC de 50-60%, uma temperatura de melting de 55-60ºC e que não tenha estruturas secundárias. Também deve conter um G ou um C nas extremidades. É recomendada a submissão dos primers desenhados em bases de dados públicas, como RTprimerDB.
Em relação aos ensaios de qPCR, deve-se fornecer a seguinte informação: códigos de acesso ao database de cada gene alvo e gene de referência; a localização dos exões; as sequências e as concentrações de cada oligonucleótido, incluindo as posições dos marcadores e/ou bases modificadas; a polimerase utilizada, bem como a concentração; a quantidade de amostra em cada reacção; a concentração de Mg2+; a composição química exata das soluções-tampão; e o volume da reacção. Também deve ser mencionado o instrumento utilizado e as condições dos ciclos de PCR, bem como todos os consumíveis que foram usados.
As condições óptimas para qPCR deverão ser testadas experimentalmente, nomeadamente o intervalo óptimo para as temperaturas de annealing dos primers, a eficiência da reacção, e a especificidade dos primers (testada por electroforeses em gel de agarose)
Além dos controlos RT-, outros controlos deverão ser utilizados, como pequenos oligonucleótidos de DNA ou RNA, cDNA clonado em plasmídeos ou DNA de amostras biológicas específicas.
A eficiência do PCR é importante principalmente quando se avaliam concentrações de mRNA de genes alvo comparativamente com os genes de referência. A diferença entre os valores de Cq (dCq) entre o gene alvo e o gene de referência é calculada, e os valores de dCq das diferentes amostras são directamente comparados, desde que os dois genes sejam amplificados com igual eficiência. A eficiência da amplificação deve ser calculada através do declive da porção linear da função logarítmica da curva de calibração, devendo ser entre 90% a 110%.
Os padrões usados para a construção da curva de calibração são, normalmente, amostras de cDNA em série de diluições de 1:10, com pelo menos oito pontos.
A curva de calibração, bem como o valor do declive, o valor da intersecção com o eixo das ordenadas e o valor do coeficiente de correlação (r2), deverá ser incluída na publicação.
A normalização é essencial para a fidedignidade dos ensaios de qPCR e para a comparação da concentração de mRNA entre diferentes amostras. O uso de genes de referência como controlos é um método muito comum, no entanto a sua validade deve ser testada experimentalmente. Esta envolve a descrição das razões das concentrações de mRNA dos genes em estudo e das concentrações do mRNA do gene de referência, devendo a expressão desse gene de referência ser constante e a sua abundância mostrar forte correlação com a quantidade de mRNA da amostra. A utilização de apenas um gene de referência não é aceitável, excepto quando os investigadores confirmarem uma expressão invariante nas condições experimentais descritas.
Dois dos factores que mais influenciam os ensaios de qPCR são a variabilidade biológica, devido às variações nas expressões de genes em indivíduos diferentes, e a variabilidade técnica, associada a erros de pipetagem, pipetas mal calibradas e/ou qualidade das amostras. Para mitigar estes efeitos, deve-se utilizar pelo menos três réplicas biológicas e duas réplicas técnicas por amostra em estudo. Se a experiência servir para comparar expressão de genes entre controlos e amostras tratadas, as três réplicas biológicas deverão ser amostras que foram tratadas em experiências independentes e separadas.
A aplicação destas sugestões leva a resultados mais fisdedignos e mais consistentes, o faz com que seja mais fácil a sua reprodução.
Fontes:
Stephen A. Bustin, Vladimir Benes, Jeremy A. Garson, et al.; The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments; Clinical Chemistry; 2009; v. 55; pp. 611-622.
Sean Taylor, Michael Wakem, Greg Dijkman, Marwan Alsarraj, Marie Nguyen; A practical approach to RT-qPCR—Publishing data that conform to the MIQE guidelines; Elsevier; 2010; v. 50; S1-S5.