A cromatografia em camada fina (TLC, thin-layer chromatography) é um método simples, rápido e barato de se obter uma resposta rápida quanto à composição química de uma dada mistura.
As placas de TLC são folhas de vidro, metal ou plástico, cobertas com uma fina camada de um adsorvente sólido, normalmente sílica ou óxido de alumínio. Uma pequena quantidade de amostra a analisar é colocada junto à base da placa, através da utilização de um capilar de vidro. Depois de carregada, a placa é então colocada na vertical, sobre uma pequena porção de um eluente adequado (de forma a que a zona basal contacte com o líquido), numa câmara saturada com o mesmo eluente.
O eluente – a fase móvel – sobe lentamente sobre a placa, por acção de capilaridade. À medida que o solvente se desloca ao longo da placa, um equilíbrio é estabelecido para cada componente da mistura, entre as moléculas que se encontram adsorvidas no sólido e as que se encontram em solução. Em princípio, os componentes irão diferir na solubilidade e na força da sua adsorção à matriz da placa, pelo que alguns componentes irão migrar mais que outros.
Quando o eluente chega ao topo da placa, a placa é removida da câmara de desenvolvimento, o solvente é evaporado e os componentes separados são visualizados. Se os compostos forem corados, a visualização pode ser feita a olho nu. Mas normalmente os compostos não são corados, sendo analisados sob luz UV (a placa contém um compostos que fluoresce com a radiação UV (toda a placa encontrar-se-á fluorescente, à excepção dos locais onde os componentes se encontram).
Quando se trata de escolher o eluente mais apropriado para a mistura em questão, deve-se testar diversos solventes, variando-os de acordo com a sua polaridade. Os resultados dos vários testes devem ser observados e registados, para avaliar qual o sistema de eluição que melhor separa os componentes da mistura.
Os resultados obtidos por TLC são, normalmente, usados para determinar-se as melhores condições para as cromatografias em coluna. Dado ser muito mais rápido, a cromatografia em camada fina é usada para avaliar-se o melhor solvente a usar nas cromatografias em coluna. Por exemplo, para determinar-se o sistema de eluição mais adequado para o procedimento de flash chromatography, o ideal é que o solvente (ou mistura de solventes) origine valores de Rf de 0,25-0,35 e que separe um composto dos seus vizinhos por uma diferença de valores Rf de, pelo menos, 0,20.
O sistema de eluição deve ter em consideração e parâmetros: toxicidade, custo e inflamabilidade. Os solventes mais usados são os hexanos (éteres de petróleo) e acetato de etilo. O dietil éter também pode ser usado, mas é muito inflamável e volátil. Álcoois (metanol, etanol) e acetona também podem ser usados. Cloreto de metileno e/ou clorofórmio (hidrocarbonetos halogenados) são bons solventes, mas devem ser evitados sempre que possível, devido à sua toxicidade. Se dois solventes forem igualmente bons eluentes e tiverem toxicidades similares, o mais volátil deve ser escolhido, uma vez que é o que pode ser evaporado com maior facilidade. Nos testes preliminares, deve-se misturar um solvente apolar (hexanos) com um solvente polar (acetato de etilo ou acetona) em diferentes proporções, para criar sistemas mais e menos polares. De seguida, deve-se preparar a câmara de desenvolvimento. Deve-se colocar o solvente na câmara (um compartimento fechado, como um frasco, ou um gobelé com um vidro de relógio), de forma a que a altura do líquido não seja superior a 0,5 cm. Para facilitara a saturação da câmara, deve-se colocar uma tira de papel de filtro na vertical.
As placas devem ser preparadas consoante o número de amostras e consoante a situação a testar. Estas costumam vir em folhas de 5×20 cm, pelo que podem ser cortadas em tamanhos diferentes. As placas devem ser manuseadas com cuidado, para não danificar nem sujar a camada do adsorvente.
Deve-se traçar, com um lápis, uma linha horizontal paralela a cerca de 0,5 cm da base da placa, sem pressionar com muita força. Abaixo da linha, marcar levemente o nome das amostras que se pretende avaliar, deixando bastante espaço entre as amostras, para não haver sobreposições. Devem analisar-se até 4 amostras numa placa de 5cm de largura.
Se a solução não se encontrar em solução, deve-se dissolver o composto numa pequena quantidade de solvente volátil (como hexano ou acetato de etilo), normalmente cerca de 1 mg em 1 mL de solvente. Usando um microcapilar, recolhe-se a amostra mergulhando-o na solução. Depois, gentilmente, tocar com a ponta do capilar no local apropriado da placa de TLC, evitando que saia muita amostra e que o ponto fique muito grande.
Depois de pronta a placa, esta é colocada na câmara de desenvolvimento, de forma a que não contacte com o papel de filtro e que se mantenha na vertical. Fecha-se a câmara e deixa-se a eluir até que a fase móvel chegue até cerca de 1cm do topo da placa. Quando atingir essa altura, remove-se imediatamente a placa da câmara, marca-se com o lápis a linha do eluente e deixa-se secar antes de se visualizar.
Se existirem algumas manchas com cor, deve-se circulá-las levemente com um lápis. Normalmente as manchas não são coradas, pelo que tem que se recorrer à iluminação por UV. Coloca-se a placa sob a lâmpada de UV e marca-se as manchas com um lápis, tendo o cuidado de não expor em demasia a pele à radiação UV (usar sempre luvas!).
O fator de retenção, Rf, é definido como a distância percorrida pelo composto dividida pela distância percorrida pelo eluente.
O valor de Rf de um composto é constante entre experiências se as seguintes condições da cromatografia também se mantiverem constantes: sistema de eluição; adsorvente; espessura da camada do adsorvente; quantidade de amostra aplicada na placa; e temperatura. Como estas condições são difíceis de se manter constantes entre experiências, geralmente são considerados os valores de Rf relativos. “Rf relativo” significa que o valor é associado a um padrão, ou significa que os valores de Rf foram comparados com um determinado composto corrido em todas as placas, ao mesmo tempo. Quanto maior o fator de retenção, maior a distância que a substância percorrera na placa. Quando se compara dois valores de Rf em condições idênticas, o composto com maior fator de retenção é menos polar, pois interage menos com o adsorvente polar. Os valores de Rf também podem fornecer evidências corroborativas na identificação de um composto. Se duas substâncias tiverem o mesmo Rf, é provável (mas não certo) que sejam o mesmo composto. Se tiverem valores diferentes, tratam-se definitivamente de compostos diferentes.
Fonte: Organic Chemistry