Testes de Susceptibilidade aos antimicrobianos | Laboratório Online

O reconhecimento do padrão de sensibilidade à terapêutica antimicrobiana é fundamental na medida em que se assiste ao aparecimento de estirpes microbianas resistentes a alguns antibióticos que, por isso, deixam de ser eficazes no tratamento das infecções.

Contudo, o antibiograma não deverá ser efectuado em espécies bacterianas de padrões de susceptibilidade e resistência conhecidos.

Por exemplo, não está indicado fazer esse estudo quando isolado Streptococcus β hemolítico já que todas as estirpes são sensíveis a penicilina. Por outro lado, o teste de pesquisa da β lactamase deverá ser efectuado quando Haemophilus influenzae e N. gonorrhoea. Estirpes resistentes à penicilina produtoras de β lactamase têm sido isoladas com grande frequência, devendo ser identificadas antes que a terapêutica antibiótica se inicie.

Existem várias técnicas para determinar a sensibilidade à terapêutica antibiótica, mas, na essência, baseiam-se na determinação da capacidade que um microrganismo tem de se multiplicar in vitro, na presença de diferentes fármacos.

Fig. 1 – Antibiograma

Em bacteriologia, o teste de sensibilidade aos antibióticos, ou antibiograma, é habitualmente executado numa placa de Petri, com um meio de cultura sólido (meio Mueller-Hinton agar­­ ⁽¹⁾). Na placa semeada por inoculação ou espalhamento (suspensão de bactérias semeadas sobre toda a superfície do meio de cultura), verifica-se que os discos de papel com antibiótico causam, se a bactéria lhe é sensível, um halo de inibição de crescimento bacteriano, enquanto que se a bactéria lhes é resistente não se forma o halo de inibição suficiente ou há crescimento bacteriano à volta do disco.

No meio líquido com antibiótico, a inibição, maior ou menor, da turvação, causada pelo crescimento bacteriano, dá-nos a medida da sensibilidade da bactéria ao antibiótico.

Em Parasitologia, no caso de alguns protozoários, e em Micologia podem ser usados métodos semelhantes com medicamentos antiparasitários ou antifúngicos.

Para avaliar in vitro a susceptibilidade bacteriana aos antibióticos ou antibiograma, podem usar-se várias metodologias:

• Métodos de diluição – utilizam-se meios de cultura líquidos ou sólidos adicionados de concentrações crescentes de um dado antibiótico. A cada um destes meios adiciona-se a mesma quantidade de inóculo (suspensão bacteriana). Após incubação a temperatura adequada, observa-se se ocorreu crescimento bacteriano. É assim possível avaliar a Concentração Mínima Inibitória (CMI, em mg/L) de antibiótico que inibe o crescimento bacteriano. É igualmente possível para alguns antibióticos determinar também a Concentração Mínima Bactericida (CMB), isto é, a concentração mínima de antibiótico que leva à morte de 99,9% da população bacteriana;

• Métodos de Difusão – utilizam-se meios de cultura sólidos em placas de Petri, a inocular com uma dada suspensão bacteriana por espalhamento à superfície do meio. Na superfície do meio sólido inoculado, colocam-se discos de papel impregnados com diferentes antibióticos. O tamanho dos halos, expresso em milímetros, e traduzido em Susceptível (S), Intermédio (I), ou Resistente (R). Vários parâmetros podem influenciar o tamanho do halo, pelo que esta técnica tem que ser padronizada. Em clínica utiliza-se muito a Técnica de Kirby-Bauer. Nesta técnica utiliza-se um meio de cultura Mueller-Hinton agar, distribuído em placas de Petri, com uma espessura de meio de cultura de 4 mm. A densidade de suspensão bacteriana a inocular deve ser equivalente a 0,5 unidades MacFarland (padrão) ⁽²⁾. A concentração de cada antibiótico nos discos de papel é determinada segundo as normas do CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute). Trata-se de um método qualitativo.

Fig. 2 – E-Teste

Recentemente foi criado um método de difusão em gelose, nas condições descritas acima, que permite avaliar a CMI (mg/L) de cada antibiótico contra a estirpe bacteriana em ensaio. Trata-se do E-Teste (Epsilon Test), em que se usa uma tira de plástico impregnada de um gradiente de antibiótico, tornando possível determinar o CMI pela linha de intercepção do crescimento bacteriano com a respectiva tira.

Actualmente existem alguns sistemas automatizados comercializados já utilizados na rotina laboratorial para a execução do teste de sensibilidade aos antimicrobianos.

Notas:

(1)  – O do meio de Mueller-Hinton agar contém 30,0% de infusão de carne, 1,75% de hidrolisado de caseína, 0,15% de amido e 1,7% de agar. O pH é ajustado a 7,00 a 25⁰C. Quando se realiza testes de susceptibilidade com espécies de Streptococcus, também se costuma adicionar 5% de sangue de carneiro de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD⁺). É ainda importante referir-se que o amido absorve toxinas produzidas pelas bactérias, pelo que deste modo os metabolitos bacterianos não interferem com os antibióticos em estudo.

(2)  – As unidades de MacFarland, usadas para medir comparativamente a turvação de uma suspensão bacteriana, são medidas através da mistura de quantidade específicas de cloreto de bário e ácido sulfúrico, que reagem e originam um precipitado de sulfato de bário. Um padrão de 0,5 unidades MacFarland corresponde à mistura de 0,05 mL de cloreto de bário diidratado (BaCl₂•2H₂O) a 1,175%, com 9,95 mL de ácido sulfúrico a 1%.

Fig. 3 – unidades de MacFarland

Fontes: Wanda F. Canas Ferreira, João Carlos F. de Sousa, Nelson Lima, et al; Microbiologia; LIDEL; Lisboa; pp. 420-422 |Padrões MacFarland | Mueller-Hinton agar