Os metabolitos secundários são sintetizados via diversas transformações químicas a partir de alguns compostos simples. Estas transformações podem dividir-se em três séries de vias metabólicas: a via do acetil-polimalonilo; a via do mevalonato; e a via do xiquimato. Dada a relevância de muitos destes metabolitos para a cosmética e para a indústria farmacêutica, testes químicos são essenciais para a correta identificação dos compostos. Os spot tests constituem uma forma simples e rápida de identificar espécies de líquenes de acordo com os metabolitos secundários que produzem. Estes testes, propostos pelo botânico William Nylander em 1866 como forma de identificação taxonómica dos líquenes, são realizados deixando cair uma gota de um determinado reagente directamente sobre a medula e/ou o córtex do líquen para se observar se há alguma alteração de cor. Uma forma de realizar estes testes consiste em encher um capilar de vidro com o reagente e depois tocar o capilar no talo do líquen. Os reagentes padrão usados nestes testes são soluções de iodo, hidróxido de potássio, hipoclorito de cálcio e p-fenilenodiamina. Na literatura técnica, estes reagentes são identificados como I, K, C e P, respectivamente. Estes testes podem ser usados tanto individualmente, como em conjunto.
I – solução de iodo
Dissolver 0,5 g de iodo e 1,5 g iodeto de potássio (KI) em 100 mL de água destilada (solução de Lugol). Alternativamente, preparar solução de Melzer dissolvendo 1 g de iodo e 1,5 g de iodeto de potássio em 50 mL de água destilada e 50 mL de hidrato de cloral (tricloroacetaldeído monohidratado).
K – solução de hidróxido de potássio
Embora a concentração não seja muito relevante, uma solução de hidróxido de potássio a 10% deve funcionar. Hidróxido de sódio pode ser usado como alternativa. A solução deve ser testada numa amostra de Xanthoria: se houver uma mudança de cor quase instantânea para carmim, então a solução é viável para os spot tests.
C – solução de hipoclorito de cálcio
Preparar de fresco uma solução aquosa de hipoclorito de cálcio. Alternativamente, pode usar-se uma solução aquosa de hipoclorito de sódio a 5,25% ou até lixívia comercial, no entanto é preciso ter em conta que a presença de iões sódio podem levar a falsos positivos. Deve testar-se a solução com um líquen comum, como Ochrolechia androgyna: se não se der uma mudança de cor intensa, a solução deve ser descartada e uma nova deve ser prepararada. Uma das maiores fontes de erros nas classificações provém de falsos negativos do teste C. Testes positivos em medula realizados no campo tende a não ser fidedignos.
P – solução de p-fenilenodiamina
Nota: a p-fenilenodiamina é alergénica e mutagénica. É tóxica quando inalada ou aquando do contacto desta com a pele.
Preparar uma solução alcoólica de p-fenilenodiamina colocando uma gota de etanol (70-96%) sobre alguns cristais deste composto. Esta solução é pouco estável e, por isso, a solução de Steiner é mais utilizada. Esta é preparada dissolvendo 1 g de p-fenilenodiamina, 10 g de sulfito de sódio em 100 mL de água e adicionar 0,5 mL de detergente.
Além destes testes, os spot tests KC e CK são também muito utilizados na identificação de líquenes. Consistem na utilização sequencial dos reagentes K e C. Adiciona-se o primeiro reagente (K para KC; C para CK), limpa-se o excesso de líquido com papel absorvente e, de seguida, aplica-se o segundo reagente (C para KC; K para CK).
Representação dos resultados
- a(s) letra(s) do(s) teste(s) em questão (I, K, C, P, KC, CK);
- um sinal “+” para mudança de cor ou um sinal “-” para a ausência de mudança de cor;
- e uma letra/palavra correspondente à cor observada.
Ocasionalmente indica-se o tipo de tecido que foi testado. Por exemplo, “Medulla K+ orange” indica que a medula do espécime testado fica laranja na presença de hidróxido de potássio. No caso de “Cortex K-, KC+R”, pode dizer-se que o córtex do espécime é insensível a K, mas apresenta uma mudança de cor para vermelho quando se adiciona hipoclorito imediatamente após a adição de KOH). A notação “K+ yellow then red” indica que a aplicação de hidróxido de potássio dá uma cor inicial amarela, que depois se altera para vermelho.
Um outro teste que é rápido e simples depende da fluorescência de alguns metabolitos secundários quando expostos a radiação ultra-violeta (UV) de longo comprimento de onda (350 nm).
A tabela que se segue sumariza os resultados positivos dos testes e apresenta alguns exemplos, bem como algumas dicas para uma melhor análise.
|
Teste |
Resultados positivos |
Exemplos |
Observações |
| K | Amarelo, vermelho, formação de cristais microscópicos; |
Phlyctis argena (vermelho, cristais) Pertusaria corallina (amarelo vivo) Cladonia polydactyla (amarelo) Xanthoria parietina (vermelho-púrpura) |
Pode ajudar limpar o excesso de líquido com papel absorvente |
| C | Rosa, vermelho, laranja (verde é raro) | Ochrolechia androgyna, Melanelixia subaurifera (medula rosa/vermelha) | Reacções rápidas e pouco duradouras |
| KC |
Rosa, vermelho (violeta é raro) |
Hypogymnia physodes (medula vermelha) | Limpar o reagente K antes de aplicar C |
| P | Amarelo, laranja, vermelho | Parmelia sulcata, Hypogymnia physodes (medula laranja)
Cladonia pyxidata (laranja-avermelhado) |
Reacções podem ser lentas (1-2 min) |
| I | Azul, violeta (vermelho é raro) | Porpidia tuberculosa, Lecidea lactea (medula violeta) | Pré-tratamento com K pode ajudar; não se usa em testes de campo |
| UV | Fluorescente, normalmente branco, azulado ou laranja | Cladonia portentosa, C. squamosa var. squamosa (branco) | O córtex pode mascarar fluorescência; tentar remover córtex |
No campo:
- Transportar reagents K e C em frascos de vidro escuros;
- Não usar o reagente P, devido à sua toxicidade;
- Reagente I não é utilizado;
- Adicionar uma pequena gota ao líquen – usar o mínimo de líquido possível, pois vai destruir a parte biológica que entrar em contacto;
- Observar com auxílio de lupa;
- Reacções podem ser temporárias e de curta duração – observar enquanto se faz o test ou imediatamente após a adição dos reagentes;
- Utilizar os tecidos mais pálidos (tentar remover as partes mais escuras do tecido);
- Quando usar UV, proteger o líquen da luz do sol.
No laboratório:
- Adicionar o mínimo de volume de reagente à amostra recolhida em campo (os testes são destrutivos);
- Se possível, observar o teste enquanto se disseca a amostra ao microscópio
- Reacções podem ser temporárias e de curta duração – observar enquanto se faz o teste ou imediatamente após a adição dos reagentes;
- Utilizar os tecidos mais pálidos (tentar remover as partes mais escuras do tecido);
- Adicionar reagente I a secções / macerados da amostra (é normalmente necessário observar-se o resultado num microscópio de alta resolução);
- Usar lâmpada UV numa sala escura.
Os spot tests são muito úteis, no entanto são uma forma muito simplista de identificar líquenes, pois apenas os identificam em grupos muito abrangentes. Por exemplo, o teste K dá uma cor vermelha a púrpura quando na presença de antraquinonas, mas não dá informação sobre que tipo de antraquinona se encontra presente na espécie em questão. Outros testes devem ser realizados para a correta identificação, nomeadamente análises por cromatografia, quer por cromatografias de camada fina (TLC), ou high performance liquid chromatography (HPLC), e por espectroscopia de massa.
Fontes: The British Lichen Society | Wikipédia | Australian National Botanic Gardens