Isolamento e quantificação de glicogénio | Laboratório Online

O glicogénio é um polissacarídeo de glucose muito ramificado que serve como reserva energética em animais, fungos e algumas bactérias. No caso do ser humano, o glicogénio é produzido e armazenado principalmente no fígado e nos músculos. Este encontra-se presente na forma de grânulos no citosol das células e tem um papel importante no ciclo da glucose – trata-se de uma reserva energética usada para mobilizar glucose de forma rápida, quando em caso de necessidade. É análogo ao amido, o polímero de glucose que funciona como reserva energética nas plantas, possuindo uma estrutura similar à da amilopectina (um componente do amido), mas é muito mais ramificado e compacto que o amido. Ambos são pós brancos quando na sua forma hidratada.

Neste artigo é explicado um método de isolamento e de quantificação de glicogénio de culturas de células:

Isolamento

1. Centrifugar cultura de células e lavar três vezes o pellet com água desionizada
2. Ressuspender células em 500 µL de uma solução aquosa de hidróxido de potássio (KOH) a 30% (p/v) e homogeneizar a mistura; incubar a 95 °C por 2 horas, para promover a lise celular.
3. Adicionar 50 µL de uma solução aquosa de sulfato de sódio (Na₂SO₄) a 35% (p/v).
4. Adicionar etanol frio à concentração final de 70-75% (v/v) e incubar no gelo por 2 horas, para precipitar o glicogénio.
5. Centrifugar a 10 000 x g, a 4 °C, por 10 minutos, remover cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender em 500 µL de água desionizada.
6. Repetir uma vez os passos de precipitação e lavagem (passos 4 e 5)
7. Lavar duas vezes o pellet com etanol 70% e 96% (v/v)
8. Secar o precipitado a pressão reduzida, no SpeedVac

Hidrólise do glicogénio em glucose

1. Dissolver o glicogénio em solução aquosa de acetato de sódio a 100 mM (pH = 4,5)
2. Tratar o glicogénio com 2 mg de amiloglucosidase a 60 ºC por 2 horas (a duração e a temperatura de incubação pode variar consoante o kit utilizado)

Alternativamente pode fazer a quebra do glicogénio em glucose através de hidrólise ácida:

1. Dissolver o glicogénio em água desionizada
2. Adicionar 300 µL de ácido clorídrico (HCl) a 4 M
3. Aquecer até à ebulição e ferver as amostras por 1 hora
4. Deixar arrefecer as soluções e adicionar lentamente 300 µL de solução aquosa de carbonato de sódio (Na₂CO₃) 2 M para neutralizar o ácido.

Quantificação

Uma vez isolado, o glicogénio pode depois ser quantificado recorrendo-se a diluições seriadas de uma solução padrão de glicogénio e a um dos muitos kits existentes no mercado. Os kits mais utilizados são os que recorrem às enzimas glucose oxidase ou hexocinase.

Fontes: Wikipédia

Bibliografia: Gründel, M. et al. (2012) Microbiology, DOI: 10.1099/mic.0.062950-0 | Rocha, D. S. et al. (2014) Cytology & Histology, DOI: 10.4172/2157-7099.1000217