O ensaio de desvio de mobilidade electroforética (mais conhecido pela designação inglesa, Electrophoretic Mobility Shift Assay – EMSA), também conhecido como análise de desvio de mobilidade em gel, ensaio de desvio de mobilidade ou análise de deslocamento em gel, é uma técnica de electroforese de afinidade que serve para estudar interacções proteína-DNA ou proteína-RNA. Este método permite determinar se uma proteína, ou uma mistura de proteínas, é capaz de se ligar a uma dada sequência de DNA ou RNA e, por vezes, permite indicar se estão envolvidas mais do que uma proteína no complexo. Os EMSA são normalmente realizados in vitro, em conjunto com a técnica de DNA footprinting, extensão de primers e experiências com sondas de promotores, em estudos de iniciação de transcrição, replicação do DNA, reparação do DNA ou processamento e maturação do RNA.
Representação esquemática do EMSA. As amostras, contendo DNA marcado e proteínas, são carregadas no gel e separadas por electroforese. Resultado da electroforese: A – controlo negativo, contendo apenas DNA; B – amostra que contém proteínas que não interagem com a sequência de DNA em estudo; C – shift de mobilidade, provocado pela interacção proteína-DNA; D – supershift, provocado pela interacção anticorpo-proteína-DNA.
O EMSA consiste na separação por electroforese de uma mistura proteína-DNA ou proteína-RNA num gel de poliacrilamida ou num gel de agarose (cerca de 1,5 a 2 horas para um gel de 15 a 20 cm). A velocidade com que as moléculas migram ao longo do gel é determinada pelo seu tamanho e carga (e, em menor extensão, pela sua geometria), pelo que moléculas diferentes têm diferentes velocidades de migração. O controlo negativo (normalmente contendo apenas o DNA ou o RNA) apresentará apenas uma banda na revelação do gel, correspondendo ao ácido nucleico livre. Caso não haja nas amostras nenhuma proteína que se ligue à sequência de DNA/RNA em estudo, as amostras terão bandas iguais ao controlo negativo (mesma distância de migração). Caso uma certa proteína seja capaz de se ligar à sequência, então o complexo, maior e mais pesado, migrará a uma velocidade mais reduzida e a amostra apresentará uma banda diferente, com uma menor distância de migração. A sequência de DNA/RNA sofre, portanto, um desvio na migração electroforética devido à formação do complexo ácido nucleico-proteína.
Sob as condições experimentais adequadas, a complexação entre a proteína e o ácido nucleico é estabilizada e o rácio DNA complexado para DNA livre irá reflectir a fracção de ácido nucleico livre e ácido nucleico ligado à proteína da mistura aquando do seu carregamento no gel. Esta estabilidade deve-se ao facto da proteína, rodeada pela matriz do gel, não ser capaz de se difundir antes de se ligar ao ácido nucleico. Se as concentrações iniciais de proteína e de ácido nucleico forem conhecidas e a estequiometria do complexo também é conhecida, então a afinidade aparente da proteína e do ácido nucleico também podem ser determinadas. O número derivado desta determinação corresponde a um Kd aparente, a não ser que o complexo tenha um tempo de semivida muito longo nas condições do gel ou se se tiver em consideração dissociação durante a electroforese. Se a concentração da proteína não for conhecida, mas conhece-se a estequiometria da complexação, então a concentração da mesma pode ser determinada aumentando a concentração da sequência de DNA até que incrementos de DNA não conduzam mais ao aumento da fracção de complexo. Comparando uma série de diluições de DNA, com concentrações conhecidas, carregadas no mesmo gel, pode calcular-se o número de moles de proteína.
Também se pode adicionar à mistura um anticorpo que reconheça a proteína para criar um complexo ainda maior, com desvio ainda mais pronunciado. Este método é conhecido por supershift e pode ser usado para identificar um complexo proteína-ácido nucleico de forma desambigua
Geralmente, carrega-se num poço extra um oligonucleótido competitivo para determinar qual é a sequência que se liga mais facilmente à proteína. O uso de diferentes oligonucleótidos com sequências definidas permite a identificação do local específico de ligação.
Uma vez determinada a interacção DNA-proteína in vitro, pode-se recorrer a um conjunto de algoritmos in silico para identificar o factor de transcrição. Oligonucleótidos com sequência consenso para o factor de transcrição de interesse irão ser capazes de competir para se ligarem, eliminando o desvio observado no gel. Se a sequência consenso prevista não competir para se ligar, a identificação do factor de transcrição pode ser analisada por Multiplex Competitor EMSA (MC-EMSA), em que grandes conjuntos de sequências consenso são usadas em cada reacção e, quando um grupo de sequências se liga, cada sequência consenso desse grupo é usada individualmente numa segunda reacção.
Para efeitos de visualização, os fragmentos de ácidos nucleicos costumam ser marcados com marcadores radioactivos ou fluorescentes ou então com biotina. Marcação com brometo de etídio é menos sensível que os restantes métodos e pode falhar em detectar ácidos nucleicos se forem usadas pequenas quantidades ou se se usarem ácidos nucleicos de cadeia simples. Quando usada a biotina, por norma recorre-se a estreptavidina conjugada com uma enzima, como uma peroxidase, para detectar os fragmentos de DNA. Enquanto a marcação do DNA com radioisótopos tem pouco (ou nenhum) efeito na afinidade de ligação da proteína, o uso de marcadores não isotópicos (como é o caso dos fluoróforos ou da biotina) pode alterar a afinidade e/ou a estequiometria da interacção em questão. A competição entre a sonda marcada e o DNA não marcado com a mesma sequência pode ser usada para determinar se a marcação afecta a afinidade de ligação ou a estequiometria.
Fontes: Wikipédia | DeCS | Thermo Fisher