O ensaio proteico Pierse BCA é um método livre de detergentes baseado no ácido bicinchonínico (BCA) para a detecção colorimétrica e quantificação total de proteínas. Este método combina a redução dos catiões cobre (II) a cobre (I) pelas proteínas em meio alcalino (o método do biureto) com a detecção colorimétrica selectiva e sensível dos catiões cobre (I) através da reacção destes com do ácido bicinchonínico. O produto da reacção, de cor púrpura, é formado pela quelatação de um catião cobre (I) por parte de duas moléculas de ácido.. O complexo solúvel em água exibe uma absorvância forte a 562 nm que é praticamente linear com o aumento da concentração de proteína dentro de um intervalo relativamente largo (20-2000 µg / mL).
O teste de BCA não é propriamente um método finito, ou seja, a cor final continua a desenvolver-se ao longo do tempo, indefinidamente. No entanto, após a incubação, a taxa de desenvolvimento da cor é suficientemente baixa para permitir a medição de um grande número de amostras de uma só vez.
A estrutura macromolecular das proteínas, o número de ligações peptídicas e a presença de quatro particulares aminoácidos (cisteína, tirosina, triptofano e cistina) são responsáveis pela formação da cor com BCA. Estudos com di-, tri- e tetrapéptidos sugerem que a extensão da formação da cor é causada por mais do que a mera soma do número de grupos funcionais formadores de cor. Assim sendo, concentrações de proteína são geralmente reportadas com referência a um determinado padrão de uma proteína comum, como a albumina do soro bovino (BSA). Prepara-se uma série de diluições de concentrações conhecidas da proteína padrão e estas são analisadas em concomitância com as amostras que se pretende quantificar. Se se requere fazer uma quantificação precisa de proteínas, é recomendado usar-se uma proteína padrão similar à proteína aque se pretende quantificar; por exemplo, a gama globulina bovina (BGG) pode ser usada como padrão quando se pretende quantificar imunoglobulinas.
Este teste pode ser efectuado tanto em tubos de ensaio como em microplacas. É preciso ter em consideração que o teste em tubos de ensaio requere maior volume de amostra de proteína.
Procedimento:
- Preparar o reagente de desenvolvimento de cor de antemão (solução de biureto + solução BCA)
- Adicionar o reagente à amostra (fazer réplicas) e homogeneizar a mistura (fazer branco apenas com água).
- Incubar as misturas:
- 37 ºC por 30 minutos
- Temperatura ambiente por 2 horas
- 60 ºC por 30 minutos (mais sensível, funciona para menores concentrações de proteína)
Nota: ao aumentar a temperatura ou o tempo de incubação aumenta-se a absorvância a 562 nm e diminui-se o valor mínimo de detecção. É conveniente aquecer em banho de água, pois aquecimento de outra forma pode introduzir erros significativos no desenvolvimento da cor.
- Deixar os tubos arrefecer à temperatura ambiente (caso seja necessário) por 5 minutos.
- Medir a absorvância a 562 nm das amostras. Medir todas as amostras em 10 minutos (para que não haja variações significativas no desenvolvimento da cor entre as amostras devido ao tempo de espera)
- Subtrair os valores do branco às restantes medições.
- Fazer curva de calibração usando os valores de absorvância das diluições da proteína padrão e traçar a recta de correlação da absorvância em função da concentração total de proteína em µg / ml. Usar a recta estabelecida para determinar a concentração total de proteína nas amostras.
Problemas:
- Não se observa desenvolvimento de cor – a solução poderá conter alguma substância quelante de catiões cobre (como por exemplo EDTA);
- As amostras mostram menos cor do que o esperado – pH da solução muito baixo ou muito elevado, que interfere com a redução do cobre e a formação do complexo;
- As amostras apresentam uma cor muito intensa – concentrações de proteína muito elevadas ou as amostras contêm lípidos (podem ser removidos por adição de 2% SDS) ou lipoproteínas;
- Todos os tubos (incluindo o branco) apresentam uma cor púrpura escura – a solução tampão pode conter algum agente reductor, algum tiol ou alguma amina biogénica (catecolaminas)
Substâncias que possam interferir com o método BCA:
Algumas substâncias são conhecidas por interferir com este método, incluindo aquelas com potencial reductor, agentes quelantes e ácidos e bases fortes. Assim sendo, é fortemente aconselhado evitar a presença de: ácido ascórbico, EGTA, Ferro, sacarose impura, catecolaminas, glicerol impuro, lípidos, triptofano, creatinina, peróxido de hidrogénio, melibiose, tirosina, cisteína, hidrazinas, fenol, ácido úrico. Outras substâncias podem interferir minimamente com o método, porém estas são as mais comuns e as que causam alterações mais significativas nas determinações.
Fontes: Pierce Biotechology | ThermoFisher