A revista Cell publicou na semana passada o artigo da equipa liderada por Bin Yang, dos EUA, onde descrevem a técnica usada para deixar ratinhos completamente transparentes assim como os seus órgãos.
Ratinhos transparentes com recurso à técnica PARS
Neste artigo são descritas três técnicas desenvolvidas no sentido de facilitar a marcação de tecidos e células no local anatómico sem ser necessária a destruição e lise dos tecidos, facilitando a localização de certas proteínas in vivo.
Técnicas
A técnica PACT (passive clarity technique) permite tornar os tecidos transparentes de forma passiva e ainda a marcação por imune-histoquímica do órgãos intactos. RIMS (refractive índex matching solution) é um meio de montagem para a observação de tecidos densos. A PARS (perfusion-assisted agent release in situ) é um método que deixa todo o organismo transparente e permite marcação por imune-histoquímica.
Vantagens
A equipa mostrou que estas técnicas são compatíveis, no modelo de ratinhos, com marcação por imune-histoquímica, fluorescência, técnica de FISH para RNA em cadeia simples e ainda permitem armazenamento por longos períodos de tempo e microscopia de estruturas celulares e subcelulares.
Adiantaram ainda que estes métodos são aplicáveis em alta resolução, em modelos altamente complexos e para fenotipagem de tecidos normais ou patológicos em órgãos intatos ou corpos.
PACT (passive clarity technique)
Esta técnica inicia-se com o cross-link e hibridização dos monómeros de hidrogel para estabilização das macromoléculas; segue-se a extração dos lívidos das estruturas formadas anteriormente com recurso a detergentes irónicos; por fim o tecido transparente é embebido em RIMS para marcação e/ou armazenamento. Estes tecidos podem depois ter marcados por imune-histoquímica ou fluorescência.
(A) Comparação da transparência de blocos de tecido com 3 mm provenientes de ratinhos adultos. (B) Avaliação da capacidade de penetração dos anticorpos necessários à marcação dos tecidos. (C) Avaliação da perda de proteínas em cérebros de ratinhos. (D) Fluroscência dos tecidos. (E) Aumento de peso e volume após o tratamento. (F-H) Marcação de Nissl. (I) Marcação anti-tirosina hidroxilase. (J) Maração anti-GFAP. (K) Marcação anti-integrinas. (L) Marcação anti-pan-citoqueratina.
PARS (perfusion-assisted agent release in situ)
(A) Esquema da técnica PARS para “clearing” e imuno marcação. (B) Comparação da transparência óptica de cérebros e outros órgãos de ratinhos adultos antes e depois da PARS. (C) Imagem representativa do aumento do volume e da transparência dos cérebros de ratinhos após PARS. (D) Imagens representativas dos tamanhos dos cérebros de ratos e das estruturas. (E) Quantificação da perda de proteínas.
A técnica PARS permite a marcação e mapeamento de proteínas sinais em todo o órgão com recurso a fluorescência, por exemplo.
Dado o interesse entre o estudo das ligações sistema nervoso central (nomeadamente o cérebro) e o resto dos órgãos, é crucial a avaliação das conexões entre o cérebro e esses órgãos intatos. A combinação da técnica de PARS com outras tecnologias permitirá aos neurocientistas criar mapas de conexões cerebrais, mas também a realização de fenotipagem em órgãos normais ou em situação patológica.
Artigo: Yang, B. et al, Single-Cell Phenotyping within Transparent Intact Tissue through Whole-Body Clearing, Cell 2014 (Ver artigo completo)