A análise de moléculas pequenas em amostras biológicas é frequentemente influenciada pela presença de proteínas. Muitos ensaios biológicos requerem a remoção prévia de proteínas. O método de remoção de proteínas por precipitação com ácido perclórico (PCA) é um dos métodos mais usados pois não só remove a maioria das proteínas presentes na amostra, como também estabiliza muitos dos analitos biológicos. A desproteinização por PCA pode ser usada como método preparativo das amostras antes de quantificação de moléculas pequenas, incluindo glicogénio, ATP, cAMP, glutationa, antioxidantes, etc…
PCA deproteinization has been successfully used in the preparation of samples prior to quantitation of an array of small molecules, including glycogen, ATP, cAMP, glutathione, antioxidants, etc …
Material
- Solução de ácido perclórico 4 M, fria
- Solução de hidróxido de potássio (KOH) 2M, fria (agente de neutralização)
Procedimento:
- Prepare as amostras de acordo com o protocolo que segue para a obtenção do produto desejado
- Mantenha as amostras em gelo
- Adicione ácido perclórico de forma a conseguir uma concentração final 1 M no homogeneizado e vortexe ligeiramente
Nota: Amostras com elevado teor proteico poderão requerer mais PCA
- Incube as amostras em gelo por 5 minutos
- Centrifugue as amostras a 13000 rpm por 2 minutos numa centrífuga refrigerada
- Transfira o sobrenadante para tubos novos
Nota: dependendo da natureza do analito, as amostras em PCA podem ser congeladas até -70 ºC por até um mês.
- Neutralize o sobrenadante adicionando o um volume equivalente de hidróxido de potássio 2 M frio; vortexe as amostras (isto irá neutralizar a amostra e precipitar o excesso de PCA; poderá haver alguma libertação de CO2, por isso ventile os tubos
- (opcional) pegue em 1 microlitro de amostra e avalie se esta se encontra a pH neutro (6,8 a 7,2)
- Centrifugue as amostras a 13000 rpm por 15 minutos numa centrifuga refrigerada; recolha o sobrenadante
- As amostras estarão finalmente livres de proteínas, neutralizadas e livres de PCA excedente. Estas poderão então ser usadas directamente nos ensaios que se pretendem efectuar
Nota: durante o processo de desproteinização as amostras sofrem uma diluição que deverá ser tida em consideração.
Fonte: abcam
Imagem: ec21.com