Quantificação de Aminas Quaternárias | Laboratório Online

Existem diversas aminas quaternárias encontradas nas células, entre as quais alcalóides, aminoácidos e derivados de aminoácidos, que desempenham inúmeras funções biológicas. Estes compostos podem ser quantificados por espectrofotometria UV-Vis.

A adição de uma solução aquosa de iodeto de potássio (KI) e iodo (I₂), solução de Lugol, às amostras, em condições ácidas, leva à formação de um sal entre os aniões periodeto (I₃^–) e as aminas quaternárias, que apresentam carga positiva. As aminas terciárias também podem ser quantificadas por este método, dado se apresentarem na forma catiónica a pH ácido. Este sal precipita quando as amostras são submetidas a temperaturas baixas. No entanto é preciso salientar que a solubilidade do sal em solução aquosa ácida aumenta grandemente com a temperatura e, por isso, é necessário que as amostras sejam mantidas frias aquando da precipitação e da remoção do solvente. Os cristais precipitados podem depois ser dissolvidos em 1,2-dicloroetano. A concentração destes compostos pode ser determinada por medição da absorvância a 365 nm, após a realização de uma curva de calibração com uma solução padrão.

Trata-se de um método analítico sensível e relativamente simples de se efectuar. A estimativa da concentração destes compostos em amostras celulares pode ser feita a partir da precipitação do sal directamente a partir de extractos aquosos não purificados.

Reagentes:

Solução aquosa de ácido súlfirico (H2SO4) 1 mol / L

Solução aquosa de ácido súlfirico (H2SO4) 0,5 mol / L

Solução de Lugol – dissolver 15,7 g de iodo sólido e 20,0 g de iodeto de potássio em 100 mL de água destilada; agitar a solução.

1,2-dicloroetano

Solução padrão – dissolver 2 mg da amina quaternária em questão em 10,00 mL de solução aquosa de ácido sulfúrico 0,5 mol / L.

Procedimento:

• Preparar diluições da solução padrão utilizando a solução de ácido sulfúrico 0,5 mol / L (concentrações entre 50 e 200 µg / mL);
• Diluir os extratos celulares 1:1 com solução de ácido sulfúrico 1 mol / L;
• Transferir 500 µL de cada amostra para tubos de centrífuga de vidro grosso incubar 1 hora em gelo;
• Adicionar 200 µL de solução de Lugol fria a cada tubo;
• Incubar as misturas a 4 ºC por 16 horas;
• Centrifugar as misturas a 10000 RPM por 15 minutos, a 4 ºC e descartar completamente o sobrenadante (a partir daqui, todas as operações podem ser realizadas à temperatura ambiente);

Nota: é fulcral remover completamente o sobrenadante, pois depois este não irá misturar-se com o dicloroetano e poderá causar interferências nas leituras da absorvância; além disso, é importante manter as misturas no frio, para garantir que os cristais não se dissolvam de novo.

• Dissolver os cristais em 5-9 mL de 1,2-dicloroetano e misturar vigorosamente, recorrendo ao vortex;
• Incubar 2-2,5 horas à temperatura ambiente, para garantir total dissolução dos cristais;
• Medir a absorvância a 365 nm usando uma cuvete de quartzo;
• Estabelecer uma recta de correlação a partir das diluições da solução padrão e as respectivas leituras de absorvância e, a partir desta, determinar a concentração de aminas quaternárias nos extractos.

Nota: convém fazer sempre uma curva de calibração para cada execução desta técnica; devem fazer-se duplicados das soluções padrão e triplicados para o caso das amostras.

Fontes:

1. Sithtisarn, P. Harinasut, S. Pornbunlualap & S. Cha-um (2009) Accumulation of Glycinebetaine and Betaine Aldehyde Dehydrogenase Activity in Eucalyptus camaldulensis Clone T5 Under in vitro Salt Stress. Nat. Sci., 43:146-152;
2. M. Grieve & S. R. Grattan (1983) Rapid assay for determination of water soluble quaternary ammonium compounds. Plant Soil 70:303-307.

Imagem: Wikimedia Commons