O prémio Nobel para a Química foi anunciado hoje e congratula três investigadores, dois norte-americanos e um romeno que trabalha na Alemanha. O trabalho subjacente ao prémio é uma tecnologia que aumenta o poder resoluto da microscópio de fluorescência, em inglês “Super-Resolved Fluorescence Microscopy”.
W. Moerner é um biofísico norte-americano que trabalha na Stanford University, Stanford, CA, EUA e que se dedica também à química física e física aplicada. Eric Betzig, também ele norte-americano, trabalha em Jannelia Farm Research Campus, Howard Hughes Medical Institute, Ashburn, VA, EUA, distingue-se nas áreas de microscopia de fluorescência e nanoscopia. Neste trabalho também o romeno Stefan Hell foi distinguido. Este investigador de origem romena e que trabalha na Alemanha, no Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen, Alemanha, German Cancer Research Center, Heidelberg, Alemanha, destaca-se nas áreas da Química Biofísica.
William E. Moerner
Stefan W. Hell
Eric Betzig
O projeto
A Dispersão natural do laser (esquerda); estrutura (meio); resolução (direita); B Dimensões dos organismos e limite de difração.
O limite de difração de Abbe define que não é possível observar distintamente estruturas que distem menos do que metade do comprimento de onda da radiação usada. No caso do microscópio óptico estamos limitados a cerca de 200 nm quando se recorre a radiação azul e a 350 nm quando se recorre a radiação vermelha. Isto condicionou a observação ultraestrutural das células que só foi possível com microscopia electrónica que apresenta uma magnitude muito inferior.
Uma versão “refinada” da lei de Abbe pode ser aplicada à fluorescência considerando a função de dispersão, isto quer dizer que a fluorescência é emitida a partir de um ponto em todas as direções e que devido ao limite de Abbe vai dispersar no espaço e aparecer com um comportamento Gauissiano. Aplicando a transformada de Fourier é possível observar uma diminuição da transformada de Fourier com o aumento da frequência, sendo zero quando a frequência espacial é 1/Δmin. Com isto define-se o limite de resolução estrutural de um microscópio.
A descoberta do microscópio de fluorescência de super-resolução
Atualmente há dois princípios que permitem obter imagens de microscopia de fluorescência muito para além do limite de Abbe. A primeira é descrita como “super-resolved ensemble fluorophore microscopy” e a segunda “super-resolved single fluorophore microscopy”. Este primeiro tipo de microscopia recorre ao conceito, que remota aos anos 90, de STED (Stimulated Emission Depletion). Teoricamente seriam usados dois lasers, um de baixa intensidade irradiaria os fluoróforos e definiria a sua estrutura. Este seguiria o limite de Abbe, já o segundo de maior intensidade e com maior comprimento de onda comparativamente com o primeiro teria intensidade zero na zona de foco e aumentava em todas as direções. As transições electrónica que advêm deste processo permite que o limite de detecção tenda para zero quando a intensidade da radiação incidente do segundo laser aumenta.
Teoricamente, seria possível mediar e observar estruturas indefinidamente pequenas, contudo temos o problema que as mostras não resistiriam a intensidades de radiação muito elevadas o que inviabilizaria o processo. Porém, o importante a reter é que não há um limite física e que poderia ser ultrapassado recorrendo a intensidade mais baixas utilizando outro ground state depletion mechanism. Os resultados experimentais mostraram uma sensibilidade nas determinações muito superior, com aumentos de resolução de 100 a 500 nm (ver imagem abaixo).
(a) Diminuição não linear da intensidade com o aumento da intensidade de STED. As imagens (b) e (d) correspondem à intensidade de fluorescência na direção x e z sem e com STED, respetivamente. (c) Distribuição da fluorescência na direção z na ausência (preto) e presença (vermelho) de STED.
Repercursões desta descoberta
A história deste tipo de microscopia é pequena, uma vez que a microscopia ensemble foi implementada em 2000 e a single apenas seis anos mais tarde. Os rápidos avanços tecnológicos permitiram a aplicação da técnica em larga escala nas ciências biológicas, como a biologia celular, microbiologia e neurobiologia. Esta técnica revolucionará a investigação ultraestrutural da células com recursos a meios mais poderosos em certas vertentes comparativamente com a microscopia electrónica.
Podes ver o documento descritivo da investigação aqui.
Fonte: Nobel Prize