Esquema do mecanismo molecular da coloração de gram proposto por Hai-Lung Dai em bactérias gram positivo (a) e gram negativo (b). A adição do violeta de cristal (CV) e do mordente resultam na formação de um precipitado (ppt.) que fica retido na camada de peptidoglicano. Após a destrutica lavagem com álcool, a espessa camada de peptidoglicano das células gram positivo retem o ppt. enquanto que a fina camada das gram negativo é degradada permitindo a saída do ppt.
Após mais de 130 anos, os cientistas podem ter finalmente descoberto como uma das mais comuns técnicas de microbiologia para identificação de bactérias realmente funciona. Inventada por Hans Christian Gram em 1884, a coloração de Gram tem como objectivo diferenciar bactérias com base em propriedades das suas membranas. Os cientistas sempre pensaram que o corante usado, violeta de cristal, era capaz de penetrar a membrana citoplasmática. Contudo um novo estudo mostra que essa pode não ser a realidade.
A coloração de Gram é normalmente o primeiro passo na tentativa de identificação de uma bactéria. Os investigadores pensavam que o violeta de cristal funcionava pois este era capaz de atravessar todas as membranas bacterianas livremente. Bactérias que coram gram positivo possuem uma espessa camada de peptidoglicano a envolver a membrana citoplasmática, o que se pensava ser capaz de reter o violeta de cristal dentro da célula. Bactérias que coram gram negativo possuem uma membrana externa à fina camada de peptidoglicano que se situa entre a membrana interna e a externa, não sendo esta suficiente para reter o corante, pensavam os cientistas.
Contudo nunca ninguém tinha realmente verificado qual o trajecto que as moléculas de violeta de cristal percorrem enquanto penetram as membranas bacterianas. Foi esse o objectivo de Hai-Lung Dai, co-autor do estudo publicado no passado mês de Abril na revista ACS Chemical Biology, que utilizando uma técnica denominada second-harmonic light-scattering juntamente com microscopia de transmissão de campo claro foi capaz de estudar esse mecanismo. Este método permitiu a Dai observar se as moléculas de corante são ou não capazes de atravessar membranas biológicas uma vez que moléculas que se encontram em movimento aleatório em solução não geram nenhum sinal, enquanto moléculas alinhadas ao longo de uma membranas emitem um forte sinal.
Dessa forma, utilizando Escherichia coli, uma bactéria gram negativo, a equipa de investigação de Dai verificou que quando adicionava violeta de cristal era possível observar-se um pico no sinal que correspondia ao alinhamento do corante na membrana externa seguido da entrada do mesmo o que levava a uma queda no sinal. Quando o corante se encontrava junto à membrana interna havia um novo aumento de sinal, mas desta vez não houve uma diminuição, o que significa que o corante não foi capaz de atravessar a membrana interna. De forma a confirmar se a experiência foi correcta, os investigadores utilizaram outro corante, verde de malaquite, uma vez que se sabe ser capaz de atravessar a membrana interna. Desta vez verificou-se um segundo pico correspondente à entrada na célula, tal como previsto.
Isto significa que o violeta de cristal distingue as bactérias entre gram positivo e negativo consoante a capacidade do precipitado formado após a adição do mordente ficar retido entre a rede de peptidoglicano e não consoante se o corante fica ou não preso dentro da célula.
Apesar do novo mecanismo contradizer o funcionamento da coloração de Gram, isso não afecta a interpretação dos resultados na mesma. No entanto, um melhor entendimento do porquê de moléculas como violeta de cristal serem ou não capazes de atravessar membranas bacterianas pode ajudar os cientistas a desenvolverem novos corantes com diferentes funções.
Fonte:
- Wilhelm, M. J.; Sheffield, J. B.; Sharifian Gh., M.; Wu, Y.; Spahr, C.; Gonella, G.; Xu, B.; Dai, H.-L. Gram’s Stain Does Not Cross the Bacterial Cytoplasmic Membrane. ACS Chem. Biol. 2015. dx.doi.org/10.1021/acschembio.5b00042
- Chemical and Engineering News – A New Spin On The Old Gram Stain